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檢驗(yàn)科人員是核酸檢測(cè)工作的主力軍，我們不但要保證檢測(cè)結(jié)果的有效性，還時(shí)刻面臨著被感染的風(fēng)險(xiǎn)。本文為大家講解《PCR實(shí)驗(yàn)室新冠核酸檢測(cè)操作注意事項(xiàng)》，重點(diǎn)從新冠病毒生理特性、熒光PCR原理、PCR實(shí)驗(yàn)室籌備規(guī)范、樣本檢測(cè)環(huán)節(jié)操作、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)分析、常見問題解析等幾個(gè)方面討論學(xué)習(xí)。
1、傳染源
目前所見傳染源主要是新型冠狀病毒感染的患者。無(wú)癥狀感染者也可能成為傳染源。
2、傳播途徑
經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播是主要的傳播途徑。在相對(duì)封閉的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能。由于在糞便及尿中可分離到新型冠狀病毒，應(yīng)注意糞便及尿?qū)Νh(huán)境污染造成氣溶膠或接觸傳播。
3、熒光PCR原理
重復(fù)進(jìn)行“變性 - 退火 - 延伸” 三個(gè)過程，模板DNA的量就會(huì)呈指數(shù)倍增加，理論上講經(jīng)過 n 個(gè)循環(huán)之后，模板量就會(huì)達(dá)到2的n次方。
4、常見問題解析
①新冠試劑出現(xiàn)翹尾，怎么處理？
答：如果是個(gè)別單一通道翹尾，不管是FAM還是VIC通道，首先按照要求復(fù)查，復(fù)查建議重新采樣，如果不方便重新采樣建議對(duì)原有樣本進(jìn)行重新提取核酸驗(yàn)證，如果復(fù)查陰性判讀陰性，如果復(fù)查還是同一通道翹尾，就要對(duì)結(jié)果仔細(xì)審核，一是要排除實(shí)驗(yàn)室污染，二是要對(duì)病人信息了解清楚，從臨床癥狀及接觸史排查，如果沒法確認(rèn)，建議必須重新采樣復(fù)查，如有必要可以采用另一家試劑來驗(yàn)證。如果出現(xiàn)大量的弱陽(yáng)性擴(kuò)增翹尾，首要原因是考慮實(shí)驗(yàn)室污染，可以通過做環(huán)境樣本和陰性對(duì)照做驗(yàn)證排除。
②N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因嗎，靈敏度哪個(gè)更高？是否會(huì)和其他冠狀病毒片段重疊？
答：N基因跟1ab都是特異的，不會(huì)跟其他呼吸道病原體交叉反應(yīng)。設(shè)計(jì)時(shí)候，兩個(gè)基因的序列不一樣，導(dǎo)致靈敏度不一樣，N基因的靈敏度比1ab靈敏度高。
答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外檢測(cè)結(jié)果也和取樣，核酸提取以及樣本本身的核酸濃度有關(guān)，需要逐一分析，同時(shí)可以結(jié)合臨床癥狀判讀。
答：因?yàn)樵噭┎捎玫氖莾?nèi)源性內(nèi)標(biāo)，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)是用人源基因標(biāo)記，此基因存在于人的表皮細(xì)胞內(nèi)，操作過程中就可能會(huì)出現(xiàn)人源性的污染，另外環(huán)境污染也有可能導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)增長(zhǎng)，這也是前面提到的建議做環(huán)境樣本質(zhì)控。
答：如果新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出，該樣本必須復(fù)查，可重新混勻該樣本提取核酸，如果重新提取該樣本內(nèi)標(biāo)還是不出，在排除提取問題的情況下，說明采樣不合格，要通知臨床重新采樣復(fù)查。
答：因?yàn)樾鹿谠噭z測(cè)的是人內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，環(huán)境樣本一般不含有人源細(xì)胞，所以檢測(cè)不出內(nèi)標(biāo)；偶爾檢出內(nèi)標(biāo)，可能該環(huán)境樣本上有人源性細(xì)胞粘附，故而檢出內(nèi)標(biāo)。
③新冠檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷不符合，怎么解讀？
④采用生理鹽水做陰性對(duì)照，內(nèi)標(biāo)也會(huì)增長(zhǎng)，怎么解釋？
⑤新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出如何處理？
⑥采集環(huán)境樣本檢測(cè)新冠狀病毒，為啥大部分樣本內(nèi)標(biāo)不出，偶爾個(gè)別樣本檢測(cè)出內(nèi)標(biāo)？
